HL-60 cells were cultured for 3 days with 1.3% DMSO to induce differentiation. Neutrophil-differentiated HL-60 cells were incubated for 5 minutes with the membrane-permeable NUCLEAR-ID Red DNA dye to stain nuclei. After three times of washing, NUCLEAR-ID Red stained-neutrophils were loaded into SIEVEWELL. RPMI containing Sytox Green (0.2 µM) and 100 ng/mL PMA was added to induce NETosis and to assess for cell death. SIEVEWELL was placed on IncuCyte® S3 System which is housed inside a cell incubator at 37°C with 5% CO2. Neutrophils were imaged using phase contrast, red (800 ms exposure) and green (400 ms exposure) channels. Images using a 20x dry objective lens were taken every 5 minutes.
Reference of reagents, scan conditions. J Immunol January 15, 2018, 200 (2) 869-879.
一つ一つのマイクロウェルの底部に約 2 μm の貫通孔が形成されています。中央のチャンバー部分に入れた細胞を含む溶液は、サイドポートからピペットで吸引することで吸い出すことができます。
細胞は上から下に向かう溶液の流れに乗って、マイクロウェルに格納されます。
Step 1
細胞の懸濁液を中央のチャンバーに入れます
Step 2
サイドポートからバッファーを吸い出します
フィルターの直径は約 2 μm。培地やPBS、バッファーといった液性成分だけが通過します。細胞はフィルター上に捕捉されており、染色や洗浄操作でもロスしません。
したがって、血中循環がん細胞CTC（ circulating tumor cell）のような希少な細胞を操作中に失うことなく、細胞の固定、透過、ブロッキング、インキュベーション、洗浄が可能です。
ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞 A549細胞は、CTCのマーカーとして知られているEpCAM (Epithelial cell adhesion molecule; 上皮細胞接着分子)の発現が低い細胞株です。
Step 1
A549細胞の播種、格納
Step 2
FITC標識マウス抗ヒトEpCAM抗体を添加し、30分間インキュベーション
Step 3
過剰な抗体を洗浄して除去。蛍光強度が非常に低く、検出が困難。
Step 4
Alexa® 488標識ヤギ抗マウスIgG抗体を添加し、30分間インキュベーション。
Step 5
過剰の抗体を洗浄して除去。蛍光標識2次抗体による2回目の染色で、蛍光強度が増強。さらなる追加染色で蛍光強度の増強が可能。
SIEVEWELL™の透明フィルターには、細胞サイズのマイクロウェルが形成されています
– マイクロウェルのサイズ; 20 μm, 深さは 25 μm.
– 370,000ウェルが17 mm x 17 mmに形成
マイクロウェルを備えたフィルターは、半導体デバイスの製造工程で使われているフォトリソグラフィーが用いられており、細胞サイズの微細な構造が正確に形成されています。
ウェルの底部に貫通孔が形成されています。細胞が貫通孔に向かって吸引されてゆき、ウェルに格納されます。そのため、シングルセル格納率はポアソン分布よりも高く、200,000個の細胞をロードした場合、90%以上のウェルが１ウェル1細胞となります。
フィルターは透明で、明視野・位相差といった一般的な倒立型光学顕微鏡での観察が可能です。
自家蛍光が細胞の検出や観察の問題となることがありますが、SIEVEWELL™のフィルターの自家蛍光は極め低く、一般的な蛍光顕微鏡での 観察を妨げることはありません。
Recommend.
Use P200 multi channel pipette for aspirating from side ports.
Single P200 pipette also work.
Do not aspirate too much.
This forms bubbles inside and dry up the surface.
Remove bubbles from side port if forming bubbles.
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